Unidad de Genómica y Bioinformática

La conocida como Secuenciación de Nueva Generación (NGS) ha supuesto una revolución para el campo de la genómica, gracias al alto rendimiento con el que cuenta en comparación con tecnologías más tradicionales, ofreciendo una amplia variedad de aplicaciones para estudiar los sistemas biológicos a un nivel más complejo.

Las plataformas desarrolladas por Illumina están basadas en la secuenciación por síntesis (SBS) en la que se realiza la detección de nucleótidos marcados a medida que estos se van incorporando a la cadena en formación. En concreto, los dos sistemas con los que contamos en la Unidad de Genómica nos permiten la secuenciación de fragmentos desde 36pb hasta 600pb, y una profundidad de secuenciación que abarca desde 1 a 400 millones de lecturas por run. Como resultado de esto se obtienen datos precisos para una amplia gama de aplicaciones:

Genómica (DNA-Seq):

• Secuenciación de genomas pequeños completos (microorganismos, virus).
• Secuenciación de exomas y grandes paneles (enrichment-based).
• Secuenciación dirigida de genes (paneles de genes, amplicones).
• Secuenciación de novo.

Transcriptómica (RNA-Seq):

• Perfil de expresión génica (Total RNA-Seq, mRNA-Seq).
• Secuenciación dirigida de perfil de expresión.
• Análisis de pequeños ARNs (miRNA y Small RNA).

Epigenómica:

• Análisis de metilación (MeDIP-Seq, RRBS-Seq).
• Análisis de la interacción ADN-proteínas (ChIP-Seq, HI-C/3C-Seq, 4C-Seq).
• Análisis de la interacción ARN-proteínas (RIP-Seq, CLIP-Seq).
• Análisis de captura de retrotransposones (RC-Seq).

Metagenómica:

• Perfiles metagenómicos (estudios de microbioma).
• Secuenciación de las subunidades 16S, 18S, ITS (ID de microorganismos).

El servicio básico de desarrollo de proyectos de NGS incluirá:

• Control de calidad inicial de las muestras extraídas.
• Normalización.
• Preparación de librerías.
• Validación de la librería por electroforesis de alta resolución.
• Pooling o multiplexado.
• Secuenciación en equipo de NGS.
• Demultiplexing y entrega Raw Data (FASTq).

A través del genotipado se consigue determinar la información genética de un organismo, genotipo, poniendo de manifiesto las diferencias entre distintos genomas. En función del tipo de estudio que se desee hacer, la Unidad de Genómica dispone de distintos tipos de tecnologías para abarcar desde estudios a pequeña y mediana escala, hasta estudios que requieran tecnologías de alto rendimiento (high-throughput) que permiten los análisis de asociación de genoma completo (GWAS).

La tecnología de microarrays supone una valiosa herramienta para la detección de variantes genéticas. Además, el formato en el que se presentan permite el procesamiento de grandes volúmenes de muestras en poco tiempo. Illumina® cuenta con una amplia variedad de kits prediseñados para el genotipado de ADN humano y no humano, así como para el análisis de patrones de metilación en el ADN, ofreciendo también la posibilidad, en muchos de ellos, de customizar el ensayo.

La Unidad de Genómica cubre las posibles necesidades de todos los investigadores disponiendo de los kits prediseñados de Illumina®, entre los que podríamos destacar:

Infinium Global Screening Array-24 V3.0 Kit

Este array cuenta con aproximadamente 654.000 marcadores (con posibilidad de añadir hasta 50.000 más), proporcionando una herramienta para el genotipado a escala poblacional, la detección de variantes, estudios de farmacogenética y la investigación en medicina de precisión.

Infinium MethylationEPIC Kit

Con el Infinium MethylationEPIC array se pueden interrogar de forma cuantitativa más de 935.000 posiciones de metilación en el genoma humano a resolución de un únjico nucleótido. Permite el análisis a partir de muestras parafinadas FFPE.

Infinium CytoSNP-850K v1.2 BeadChip Kit

Este kit engloba una lista de genes basada en el contenido de la Colaboración Internacional para la Genómica Clínica (ICCG) y el Consorcio de Genómica del Cáncer (CGC), de manera que, con hasta 850.000 marcadores, proporciona una visión general y completa de genes de reconocida relevancia citogenética tanto en aplicaciones convencionales como de cáncer.

Para más información sobre las posibilidades que esta casa comercial ofrece visite https://www.illumina.com/index-d.html.

El servicio de análisis de genotipado y metilación con microarrays de Illumina® incluye:

• Control de calidad de las muestras extraídas: verificación de la calidad y la concentración.
• Normalización.
• Amplificación de ADN genómico, tratamientos enzimáticos, marcaje de array, escaneado en el equipo y obtención de datos.
• Generación y envío de resultados de análisis preliminar.

La PCR digital supone un nuevo enfoque en la detección de ADN que proporciona una cuantificación absoluta y la detección de dianas de forma más eficiente y precisa que la PCR cuantitativa, todo ello sin la necesidad de usar estándares o patrones de referencia. Desde su aparición ha sido fundamental para detectar variantes raras, proteínas de fusión y para el trabajo en biopsia líquida.
En la Unidad de Genómica contamos con el equipo QuantStudio Absolute Q Digital PCR System de Applied Biosystems™, para llevar a cabo las reacciones de PCR digital, el cual genera datos absolutos de cuantificación con una elevada precisión y sensibilidad.
Entre las aplicaciones que esta tecnología permite encontraríamos:

• Detección y cuantificación de CNV con alta precisión.
• Detección y cuantificación de alelos raros.
• Cuantificación absoluta de la carga bacteriana y viral, y recuento absoluto de patógenos.
• Cuantificación absoluta de librerías de NGS y validación de resultados de secuenciación, sin necesidad de estándares de referencia.
• Detección de cambios en la expresión génica para la cuantificación absoluta de la transcripción.
• Detección y cuantificación absoluta de mutaciones en plantas y organismos genéticamente modificados.

La PCR en tiempo real es una técnica ampliamente empleada para numerosas aplicaciones tanto cualitativas como cuantitativas. Para llevar a cabo es tipo de ensayos contamos con hasta 4 plataformas diferentes: ABI Prism 7900HT, ABI Prism 7500, QuantStudio™ 6 Flex Real-Time PCR System y QuantStudio™ 12K Flex System, de Applied Biosystems™.

Los servicios ofertados dentro de esta categoría englobarían:

• Diseño de primers y sondas óptimos, en función de la naturaleza del ensayo a realizar.
• Selección de genes candidatos en las distintas BBDD, atendiendo a alguna categoría en particular como función biológica, localización celular, posición cromosómica, etc., de interés para el usuario.
• Identificación de genotipos de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en estudios de discriminación alélica.
• Análisis de variación en el número de copias (CNV) de un determinado gen.
  Determinación de los niveles de expresión de transcritos de interés (ARNm) mediante RT-qPCR.
• Variaciones de splicing: selección de exones anotados, diseño de primers, RT-PCR y electroforesis.
• Análisis de microRNAs, mediante el uso de primers específicos.
• Análisis de High Resolution Melting (HRM), ya sea para la detección de diferencias en la metilación entre genes (MS-HRM) o para la búsqueda de mutaciones en secuencias diana.

Basada también en la PCR a tiempo real, la tecnología OpenArray™ permite llevar a cabo análisis de expresión génica, identificación de genotipos de SNPs, análisis de microRNAs o ensayos de farmacogenómica a través de ensayos TaqMan™ prediseñados o nuevos que pueden ser seleccionados para adaptarse a los requerimientos de su experimento.

En función del análisis a realizar, existen hasta 11 posibilidades de configuración de experimentos prediseñados adaptados a nuestro sistema QuantStudio™ 12K Flex System, de Applied Biosystems™.

Para más información sobre el diseño de experimentos, visite la web de ThermoFisher: https://www.thermofisher.com/es/es/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-openarray/open-array-panel.html.

A través del sistema Bioanalyzer 2100 y TapeStation 4200 de Agilent podemos determinar la calidad de los ácidos nucleicos, tanto ADN como ARN, de forma automatizada mediante un proceso de electroforesis de alta resolución.

Este procedimiento se ha convertido en punto imprescindible en muchos de los flujos de trabajo de un laboratorio de genómica, destacando sobre todo como control de calidad de la cantidad, integridad y pureza del ADN y ARN en los procesos de generación de librerías para NGS, requiriendo volúmenes muy pequeños de muestra.

Aplicaciones del análisis de ácidos nucleicos en Bioanalyzer 2100 y TapeStation 4200:

• Control de calidad de librerías de ADN/ARN en todo el flujo de trabajo de NGS: cuantificación y tamaño de los fragmentos.
• Control de calidad y valoración de la integridad en muestras de ARN.
• Análisis del contenido en microARNs en muestras de TotalARN.
• Control de calidad de ADN en muestras de FFPE.
• Optimización en el diseño de ensayos para qPCR.

Sonicación

Los equipos de sonicación se han convertido en un instrumental esencial en cualquier laboratorio dedicado a la investigación en genómica. Con el E220 Focused-Ultrasonicator, de Covaris®, conseguimos una alta precisión en el control de todo el proceso gracias a la tecnología AFA que consigue dirigir la onda al centro del pocillo.

Entre las aplicaciones que nos permite esta tecnología encontramos:

• Fragmentación de moléculas de ADN/ARN, con adaptación de los ciclos y los tiempos en función del tamaño de molécula deseado.
• Fragmentación de cromatina.
• Extracción de ácidos nucleicos y proteínas.
• Homogeneización de muestras.

PCR de punto final

En la Unidad de Genómica contamos con varios equipos para desarrollar PCR convencional: Veriti™ Dx Thermal Cycler y GeneAmp® PCR 9700, de Applied Biosystem™.
Estos equipos se encuentran repartidos en dos áreas físicamente separadas para cubrir todo el rango de aplicaciones en los que son necesarios. Así, un área de pre-amplificación (libre de amplicones), en la que se utilizarán en procesos como generación de librerías para NGS, períodos de incubación en protocolos de purificación de muestras, proceso de conversión bisulfito para estudios de patrones metilación, etc. Los ubicados en el área de post-amplificación, serán usados para la amplificación de regiones de interés del genoma en estudio.

Análisis espectrofotométrico y fluorométrico de ácidos nucleicos

Casi la totalidad de las aplicaciones que se desarrollan en un laboratorio de genómica requieren de pautas previas que den información sobre la calidad y la concentración de las muestras.
Contamos con diferente equipamiento para obtener esta información:

• NanoDrop™ 2000c (ThermoFisher Scientific), espectrofotómetro de UV-visible, que a partir de un volumen mínimo de muestra (0,5-2 µL) nos da información sobre la concentración de ADN, ARN, proteínas, etc., además de evaluar la pureza y calidad de las soluciones a través de los ratios 260/280 y 260/230.
• Qubit 4 (ThermoFisher Scientific), fluorómetro que utiliza sondas fluorescentes de unión a ADN, ARN, proteínas, etc., proporcionando una medida más específica de concentración de las muestras.

NextSeq 500 (Illumina®), es una plataforma de nueva generación para secuenciación masiva de ADN. Permite la secuenciación de genomas completos, exomas, paneles dirigidos y transcriptomas, entre otros, con muy alto rendimiento, basado en la reconocida química “Sequencing By Synthesis” (SBS).

El sistema NextSeq 500 es muy versátil. Permite la secuenciación de media a alta escala, lo que hace que pueda adaptarse a multitud de proyectos distintos sin comprometer su rendimiento y su eficiencia óptimos. Permite la realización de estudios de perfil de la expresión génica, mRNA-Seq, análisis de pequeños ARNs, estudios de epigenómica, secuenciación dirigida de genes, secuenciación de exomas y grandes paneles, además de la secuenciación de genomas completos.

MiSeq (Illumina®), es otra plataforma de NGS basada también en la tecnología SBS, capaz de ofrecer datos de alta precisión y un rendimiento sólido para una amplia gama de aplicaciones: secuenciación de genes dirigidos, genomas pequeños y amplicones, metagenómica 16S, etc.

Es capaz de realizar lecturas paired-end de hasta 15 Gb por carrera, proporcionando datos de secuencias de más de 600 bases por lectura. Una plataforma compacta todo en uno que incorpora además análisis de datos y acceso a Sequence Hub de BaseSpace™ (la plataforma de análisis genómico de Illumina).

La plataforma iScan (Illumina®) es un escáner de alta resolución de microarrays basado en la tecnología “Bead-Based microarray”.

Cuenta con micromatrices cubiertas por cientos de miles de microesferas que portan copias de oligos específicos. Estos actúan como secuencias de captura para una amplia gama de aplicaciones para el análisis de ADN.

El sistema iScan va acompañado de una amplia variedad de ensayos y kits para genotipado de genoma completo o específico, perfiles de metilación y análisis citogenético, disponibles desde la web de Illumina: https://emea.illumina.com/systems/array-scanners/iscan/products-services.html

Dos equipos QuantStudio™ 6 Flex Real-Time PCR System, Applied Biosystems™ con bloques para 96 y 384 pocillos. Los sistemas QuantStudio cuenta con la tecnología OptiFlex, la cual permite el multiplexing avanzado para la cuantificación de múltiples genes dentro del mismo experimento. Este sistema permite realizar en la misma secuencia ensayos basados tanto en TaqMan como en SYBR, facilitando una mayor flexibilidad en el diseño experimental.

Sistema QuantStudio™ 12K Flex System with OpenArray™. Permite analizar de 1 a 12.000 reacciones en una sola carrera, y hasta 110.000 reacciones en un solo día, cuando se combina con el sistema AccuFill QuantStudio 12K Flex OpenArray. Es una tecnología que abarata el coste y reduce el tiempo de manipulación.

Dos plataformas 7900HT de Applied Biosystems™, con bloques para 96 y 384 pocillos y un bloque para tarjetas microfluídicas. Sistemas de PCR a tiempo real con capacidad para el análisis de 1-30 posiciones en 384 muestras. Además, un sistema de PCR a tiempo real 7500 de Applied Biosystems™, plataforma calibrada para una amplia gama de fluoróforos disponibles: FAM™⁄SYBR™ Green I, VIC™⁄JOE™, TAMRA™⁄CY3, ROX™⁄Texas Red y CY5.

Applied Biosystems™ lanza en 2022 su nuevo sistema para PCR digital, el QuantStudio Absolute Q Digital PCR System. Esta nueva plataforma se basa en la tecnología de placa de matriz microfluídica (MAP) que permite concentrar la mayor parte del flujo de trabajo en un único instrumento (compartimentación, ciclo térmico y adquisición de datos), minimizando los pasos prácticos y maximizando la uniformidad de los ensayos.

• Termocicladores:
  – Seis sistemas VeritiTM Dx Thermal Cycler
  – Sistema SimpliAmpTM Thermal Cycler
  – Dos sistemas GeneAmp® PCR 9700
• Sistemas de cuantificación de ADN, ARN y proteínas:
  – Bioanalyzer 2100. (Agilent Technologies)
  – 4200 TapeStation. (Agilent Technologies)
  – NanoDrop™ 2000c (Thermofisher Scientific)
  – Qubit™ 4 (Thermofisher Scientific)
  – Dos Sistemas ImageQuantTM LAS 4000 (GE Healthcare Life Sciences)
• Robot:
  – Robot Freedom EVO.100 (Tecan)
  – Tres sistemas automáticos de extracción de ácidos nucleicos QIAcube Connect (QIAgen)
  – Sistema automatizado de extracción de ácidos nucleicos Maxwell (Promega)
  – Equipo de ultrasonicación de onda dirigida E220 Focused-ultrasonicator (Covaris)
  – Distribución de líquidos automatizado para preparación de muestras
• Campanas y seguridad:
  – Campana AURA de flujo laminar, con filtro EPA y luz UV.
  – Armario extractor de aire de seguridad ASECOS.
  – Campana de extracción tipo 1, SCALA.